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几种重要动物病毒超高静水压灭活试验研究

张安国1 贾培起2
庞运通1 侯金伟1 王银娟1 贺守红1
(1.天津农学院动物科学系 300384,2.天津市森森生物工程技术有限公司 300100)

    本研究旨在试验探讨利用超高静水压技术,对鸡的几种重要传染病病毒进行超高静水压灭活条件及灭活效果的研究,将为天津市森森生物工程技术有限公司研制的“超高压生物处理试验机”的开发使用,利用该技术研制相关疫苗提供依据。

1 试验材料和方法


1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器 超高压生物处理试验机,由天津市森森生物工程技术有限公司研制,第一次试验用1号机,第二次试验用2号机,第三次试验用HPB.A2-600/0.4型机。净化工作台、高压灭菌器、干热灭菌器、恒温培养箱、细菌滤器、离心机、微型震荡器、微量移液器、微量试验板等,为天津农学院动物科学系动物预防医学实验室常规仪器。
1.1.2 几种重要动物病毒 新城疫病毒La sota株(NDVL)、禽流感病毒H5株(AIVH5)、禽流感病毒H9株(AIVH9)、鸡传染性支气管炎H52株(IBVH52)、鸡传染性支气管炎肾型株(NIBV03)、鸡传染性支气管炎腺胃型株(GIBV02)。其中IBVH52、NIBV03、GIBV02为冠状病毒。为天津农学院动物科学系动物预防医学实验室常鉴定保存毒种。
1.1.3 试验鸡胚 天津市西青兴华养鸡场提供,鸡胚健康,相关抗体效价较低或检测不到。
1.2 试验方法
1.2.1 病毒活化 将各病毒种毒用灭菌生理盐水,无菌1:100稀释后,接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,37℃培养72~96小时,4℃冷藏10小时以上,收取病毒液,分装保存,检测病毒效价。即为繁毒用种毒。
1.2.2 病毒繁殖 将各病毒种液用灭菌生理盐水,无菌1:100稀释后,接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,37℃培养72~96小时,4℃冷藏10小时以上,收取病毒液,分装保存,检测病毒效价。即为试验用病毒液。
1.2.3病毒液无菌分装 将各试验用病毒液过滤除菌,无菌分装于特制灭菌塑料袋中、封口、标记。
1.2.4病毒超高静水施压 将装有各试验病毒液塑料袋置于超高压生物处理试验机施压缸的液体中,通电下移活塞施压。当达到预定压力时,按预定时间维持压力。时间到后,上行活塞减压。取出病毒液塑料袋,检查袋封无损后备检。
1.2.5压力时间预定 各病毒液预定施压压力和时间:第一次静水压力设为200Mpa、250Mpa、300Mpa,各压力下保压时间设为20、30、40、50分钟。第二次静水压力设为300Mpa,分别保压20、30分钟,及在350Mpa、400Mpa静水压力下分别保压30分钟,450Mpa分别保压30、50分钟。第三次300Mpa保压20分钟,400Mpa保压30分钟,450Mpa保压30、50分钟,500Mpa保压15分钟。每次试验同时作各病毒液未施压处理的同条件对照。
1.2.6 病毒灭活效果测定 将各试验施压灭活的病毒液,用灭菌生理盐水,无菌操作进行1:10稀释,接种10日龄鸡胚,每胚0.2ml,37℃培养72~96小时,4℃冷藏10小时以上,收取接种鸡胚尿囊液,分装保存,检测病毒效价。同时观察鸡胚病变并做记录。第一次共2种病毒12个处理,分别为200Mpa、250Mpa、300Mpa各静压灭活20、30、40、50分钟。第二次共1种病毒6个处理为300Mpa、350Mpa、400Mpa、450Mpa静压灭活20、30、50分钟。第三次补作3种病毒6个处理,即300Mpa保压20分钟,400Mpa保压30分钟,450Mpa分别保压30、50分钟,500Mpa保压30分钟,550Mpa保压15分钟。同时作各病毒液的未施压同条件对照,接种鸡胚培养及观察测定等。


2 结果
2.1 病毒活化测定结果 各病毒种毒鸡胚接种培养活化后,检测得各病毒液效价如下:新城疫病La sota株(NDVL)HA效价为211,禽流感病毒H5株(AIVH5)HA效价为29,禽流感病毒H9株(AIVH9)HA效价为29,鸡传染性支气管炎H52株(IBVH52)EID 效价为10-7.2/0.2ml,鸡传染性支气管炎肾型株(NIBV03)EID 效价为10-6.8/0.2ml,鸡传染性支气管炎腺胃型株(GIBV02)EID 效价为10-6.5/0.2ml。
2.2 病毒繁殖测定结果 各试验前繁殖病毒液效价与2.1项相同。
2.3 病毒灭活效果测定结果 各施压灭活病毒液,无菌稀释后接种10日龄鸡胚,培养后,收取可疑尿囊液(病毒液),观察鸡胚病理变化和检测病毒效价结果。三次测定结果分别见表1、2、3。
2.4 确定各病毒灭活条件 统计分析确定各病毒株的超高静水压灭活条件。


3 小结
3.1 在第一次试验范围内,250Mpa 50 min ,300Mpa 20 min、30 min、40 min、50 min可完全灭活AIVH9和AIVH5 。

表1 第一次病毒灭活效果测定结果

压 力

时间(分钟)

AIVH9

AIVH5

200Mpa

20 min

>26

>26

30 min

>26

>26

40 min

>26

>26

50 min

>26

>26

250Mpa

20 min

>26

>26

250Mpa10min
225Mpa20min

>26

27

40 min

>26

27

50 min

0

0

300Mpa

20 min

0

0

30 min

0

0

40 min

0

0

50 min

-

-

对 照

空白 0

>26

>26

    注:表中NDVL、AIVH9、AIVH5为测得的病毒HA效价;NIBV03、IBVH52、GIBV02为观察鸡胚病变的结果,++++为约80%有病变,+++为约60%有病变,++为约40%有病变,+为约20%有病变,0为无病毒效价或无病变,-为未作。下同。

表2 第二次病毒灭活效果测定结果

压 力

时间(分钟)

GIB02

300Mpa

20 min

++++

30 min

0

350Mpa

30 min

0

400Mpa

30 min

0

450Mpa

30 min

0

50 min

0

对 照

空白 0

++++

 

表3 第三次病毒灭活效果测定结果

压 力

时间(分钟)

NDVL

IBHV52

NIBV03

300Mpa

20 min

28

-

+++

400Mpa

30 min

-

+++

+++

450Mpa

30 min

28.5

++

+++

50 min

0

0

++

500Mpa

30 min

0

0

0

550Mpa

15 min

0

0

0

对 照

空白 0

>210

+++

++++

3.2 第一次试验证明,250Mpa 50 min 、300Mpa 20 min 可使HIVH9、HIVH5的完全灭活。
3.3 第二次试验证明,300Mpa 30 min可使GIB02完全灭活。
3.4 从第一次试验可以看出,病毒灭活主要与静水压力的大小关系密切,而似乎与加压时间(20 min以上)的长短关系不大。
3.5 第三次试验结果明了。450Mpa50 min、500Mpa30 min、550Mpa15 min 可灭活NDVL 和IBHV52。500Mpa30 min、550Mpa15 min 可灭活NIBV03。


4 结论
4.1 新城疫病La sota株(NDVL)和鸡传染性支气管炎H52株(IBVH52)的灭活条件相同,均为450Mpa50 min及以上。或增加压力或延长时间均可达到灭活目的。
4.2 禽流感病毒H5株(AIVH5)和H9株(AIVH9)的灭活条件是250Mpa50 min及以上,或增加压力或延长时间均可达到灭活目的。
4.3 鸡传染性支气管炎H52株(IBVH52)的灭活条件相同,均为250Mpa50 min及以上,或增加压力或延长时间均可达到灭活目的。
4.4 鸡传染性支气管炎腺胃型株(GIBV02)灭活条件较高,为500Mpa30 min及以上,或增加压力或延长时间均可达到灭活目的。

参考文献
[1] 圆池耕一郎. 食品工业,1994,4:27~32
[2] Zhaev M.et al. Trends Biotechnol,1994,12:493~501
[3] 池元斌,夏咸柱,王雪梅,等. 犬瘟热病毒的静水压灭活。中国兽医学报,2001,20(1):35~37
[4] 夏咸柱,池元斌,余 春,等. 犬瘟热病毒高压灭活疫苗的制备与应用。中国兽药杂志,2000,34(2):6~8
[5] 余 春,夏咸柱,池元斌,等.犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究。中国兽医科技,2000,30(5):5~7

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