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高压处理在乳制品业的应用

贾津春 译
天津市华泰森淼生物工程技术有限公司

    概论
    高压研究人员B.H.Hite选用牛奶作为媒介,用于研究高压进行食品保鲜,这并不是一种偶然(Hite)。由于巴斯德关于白酒、啤酒腐坏的著作,食品微生物学的重要性最近也变得十分明显。巴斯德的发现引领了加热杀菌牛奶的新领域,特别是杀灭新生菌,并阻止与其相关的疾病。这种杀菌方式在19世纪80年代被首次命名为“巴氏杀菌法”。19世纪90年代,对Hite来说,接下来的挑战就是研究高压对牛奶的保鲜。
    在过去的一个世纪,热处理杀菌牛奶及奶酪已变得十分广泛,并为人们所接受,但还有高-温-短-时(HTST)加工、超-高-温(UHT)加工这样的合法概念(Earyly, 1998)。基于热处理方式的稳定性、及微生物对压力的耐压性(Patterson et al., 1995),高压处理代替热处理生产大批可供消费者每天食用的安全奶制品是不可能的。
    然而,科研人员为什么还要继续研究高压对牛奶及乳制品的作用(可参看Trujillo, et al., 1997; Balci & Wibey, 1999;Datta & Deeth, 1999 )? 热处理对某些小生境*食品并不合适,而高压处理可改善微生物的质量(例如,生鲜的奶酪制品)。其主要原因为高压可使牛奶的成分得到改善(特别是蛋白质),从而使牛奶中某些成分的功能发生变化,而改善乳制品。在这里还需要再次指出,热处理已被证明为可增强牛乳蛋白质特性一种有效的处理方式。然而,热处理和高压处理在牛乳蛋白质的结构、交互、特性方面存在不同的作用。这章即将概括论述牛乳蛋白质、在论述压力对牛奶及乳制品产生作用之前,参考温度对牛奶及乳制品的影响。
    *niche:指关键性、独特性的核心技术(如创新设计、技术能力、行销通路、数据库、制造能力、品牌等)


    牛乳蛋白质
    乳制品是高质量蛋白质并不昂贵的来源。牛乳中蛋白质的含量一般都为3.5%左右(山羊奶中蛋白质的含量基本与牛乳中相同,而母羊奶中蛋白质的含量稍高一些,为5.5%)。酸奶酪中蛋白质的含量为5%,而干酪中的含量大概为25%,当然,这要依据乳制品的种类。主要的牛乳蛋白质是酪蛋白(大约占蛋白质总数的80%)。牛酪蛋白包括单独的四种基因产物,αs1-、αs2-、β-、К-酪蛋白,这些基因物质交互作用而形成胶态离子。可溶性蛋白质或乳清蛋白质包括β-乳球蛋白(β-lg),α-乳白蛋白(α-la),血清白蛋白、免疫球蛋白、多种酶。可以在Fox和McSweeney(1998)中得到牛乳蛋白质较详细的信息。
    个别酪蛋白有许多较重要的特点。这些酪蛋白为体积较小、柔软、并具有表面疏水特性的分子。这些酪蛋白为磷蛋白质(磷蛋白质拥有有机磷光体特性,可使其酯化为丝氨酸残留物)。磷酸盐基的数量可在1(К-酪蛋白)-13(αs2-酪蛋白)、αs2-到К-酪蛋白间变动,同时每摩尔含有2个胱氨酸残留物。重要的乳清蛋白质、β-lg也含有2个胱氨酸残留物(作用于分子内部的二硫化物结合的产物)、每摩尔1个胱氨酸残留物;α-la包含4个作用于分子内部的二硫化物结合的产物(S-S)、并不含有自由氢硫基(SH)。β-lg和α-la都不含有磷丝氨酸残留物。在牛奶的pH值下(酸碱度),β-lg自然状态下主要以二聚物的形式存在,单体间的疏水作用使得这种二聚物稳定性存在,自由氢硫基被保护在单体与单体之间的界面上。
    酪蛋白胶态离子是以蛋白质聚合的形式构成的,直径在50-500nm之间不等。Horne(1998)最近提出的胶态离子结构模式指出:酪蛋白之间的联合是受引力疏水交互作用的平衡以及静电排斥的平衡控制的。在牛奶正常的pH值下,20-30℃ 的范围内,磷酸丝氨酸残留物上的负电荷被胶质磷酸钙中和了,这就使蛋白质交叉结合,并允许分子临近的疏水区域产生交互作用,从而使胶态离子更进一步的粘合。产生这些现象可使К-酪蛋白在胶态离子表面聚合。因为К-酪蛋白拥有单疏水区,并不能形成胶质磷酸盐桥,它能组织进一步的聚合。可参看Horne著作中关于此话题较详细的描述。以胶态离子模式的关系解释高压对牛乳蛋白质的影响。


    温度对牛乳蛋白质的影响
    在描述压力以前,首先要阐述一下传统的热加工、及冷却加工方式。要抑制微生物生长、及牛乳酶的活性,在牛奶运往奶场进行杀菌消毒以前,应该在农场把生牛奶冷却到4℃。在低温下,牛奶的疏水链接减弱,在4℃的情况下,有大部分的β-酪蛋白、К-酪蛋白从胶态离子中分离出来。在温热的环境中,这种过程具有可逆性。因为酪蛋白胶态离子具有热稳定性,可通过UHT处理(140℃/5-s)、蒸馏处理(115℃/20-min)对牛奶进行杀菌处理。过度加热可导致脱磷酸作用,同时可使二硫化物粘合体在胶态离子内重新排列。然而,在正常的加工条件下,升高的温度可增强疏水链接、粘合胶态离子的整体性。
    酪蛋白比乳清蛋白质更耐热。在高于70℃的条件下,加热1分钟可导致原始球状结构逐步损失。免疫球蛋白和血清白蛋白是最易受影响的。β-lg在80-90℃的范围内,发生非还原性变性。α-la是最具耐热性的;若超过90℃的温度加热1分钟,则可使α-la产生大量的变性(Law et al., 1994)。变性可导致构象改变、溶解性降低(pH=4.6)、聚合的形成。在85℃的情况下,加热脱脂乳20分钟,可引起含有蛋白质的巯基丙氨酸之间络合物的形成,这种络合物的形成是通过分子间二硫化物链形成的分子间桥的重组而形成的(Corredig&Dalgleish, 1996)。形成的主要络合物在β-lg、К-酪蛋白之间。这两种络合物都含有自由氢硫基组,此氢硫基组可促进分子间的交互作用,但这种氢硫基并不是唯一形成的络合物。另外,α-la粘合在胶态离子表面。加热可引起牛奶乳清蛋白质的变性、酪蛋白胶态离子络合物的形成,这些都对蛋白质的功能有着较严重的影响,即:影响乳制品(酸奶酪、干酪)的质量。请参看Fox(1995)的著作,即可获得更多关于温度对牛奶影响的信息。


    压力处理对牛乳蛋白质的影响
    当脱脂乳在室温或低于25℃的条件下进行压力处理的话,可发现脱脂乳的形态发生了变化。一些作者总结说,在压力处理之后,脱脂乳看起来为半透明、绿黄色(偏绿的黄色);少数浑浊、蓝白色(参看第六章)。这些主观所观察到的现象可以被量化,表10即为:压力增强的情况下,脱脂乳在颜色参数、浑浊度、透明度的改变状况。伴随着压力增强,脱脂乳的光亮度(L*)、浑浊度降低,而透明度上升,特别是压力在200-400MPa这个范围内,此现象也就越明显(Johnston et al., 1992; Desobry-Banon et al., 1994)。如果压力超过400MPa,在原来发生变化的基础上,脱脂乳不会再发生任何变化。
    牛乳蛋白质光-散射的改变(酪蛋白胶态离子破坏的直接原因)引起了牛乳颜色参数及浑浊度的变化(Needs et al., 2000a)。传输电子显微镜显示了压力处理对胶态离子结构的影响。
    若压力≥400MPa(温度≤25℃),胶态离子就会分解为小粒子,这些小粒子可形成不规则形状的聚合体。高压可引起疏水表面的增强,这是通过荧光探针8-萘酚-1-萘硫烷(ANS)键联的增强而表现出来的(Johnston et al., 1992; Gaucheron et al., 1997)。ANS键联的增强与粒子尺寸的减少密切相关。这就说明了受压的酪蛋白表面具有疏水性,即可导致胶态离子碎片聚合成不规则形状的粒子(图10-1)。现今已有大量的信息关于压力处理的牛奶中胶态离子的形态、酪蛋白粒子尺寸的测量(Schmidt&Buchheim, 1970; Schibauchi et al., 1992; Desobry-Banon et al., 1994; Gaucheron et al., 1997; Needs et al., 2000b)。然而还缺乏关于压力处理过程中牛奶成分改变这样的信息。显示了压力处理下脱脂乳样品激光透射的变化(Kromkamp et al., 1996)。300MPa压力下,在刚开始的10分钟内,光透射迅速上升,在接下来的20分钟内则表现为持续不变的水平。当卸压时,光透射表现为小幅度的瞬间下降,然后逐步下降,直到试验结束。透射的最终曲线幅度要比最初曲线幅度高。200MPa压力时,光透射上升,但卸压时光透射则恢复为原始状态。这些试验结果暗示,压力下胶态离子分裂的程度要比压力处理下观察样品中的胶态离子分裂程度高。同时,分裂并不是瞬时的,而与时间密切相关,特别是低压下。以上的观察说明:胶态离子的形态可在压力处理冷却的牛奶中找到。然而,酪蛋白胶态离子非常具有活性,加温的压力处理可使这些不规则胶态离子聚合成新的球状胶态离子。
    还没有明显的迹象说明,高于600MPa的压力引起的酪蛋白胶态离子分裂可使Ca++增加(Johnston et al., 1992)。然而,却观察到了可溶性钙元素的增加(Kneifel et al., 1993; LójpezFandiňo et al., 1998)。Anema et al. (1997)提出,高压可有效改变胶质及可溶性钙元素的平衡,这些可导致胶态离子的分裂(Schrader et al., 1997)。在标准气压下,胶质磷酸钙的可溶性依赖于pH值的大小;在牛奶标准pH值下,这种平衡通常倾向于胶质状态。压力下,脱脂乳的pH值也会发生改变,但改变的幅度却是未知的。为压力处理脱脂乳中钙元素溶解性标准。200-300MPa的压力可使钙溶解度达到最高,并且那些溶解钙可保持不变,或溶解度下降(绵羊奶例外[López-Fandiňo et al., 1998])。通常测量溶解钙元素的方法即为压力处理牛奶超速离心法,紧接着是上层清液原子吸收分光谱测量法。可溶钙元素以附着在单个分子上的磷酸钙形式存在(Johnston et al., 1992),或以小酪蛋白络合体(并非沉淀)的形式存在。溶解钙的增长是伴随溶解磷的增长而增长的,这就可支持上述观点。用超速离心法分离的50000克压力处理山羊奶中血清蛋白质的标准在200MPa时最高(Law et al., 1998)。胶质磷酸钙结构的溶解性(作为第一步)可导致压力处理阶段胶态离子的分裂,这一点是有可能的,但还需要进一步直接的迹象来证明此观点。
    压力可引起乳清蛋白质变性。科研人员已经研究出净化蛋白质(主要为β-lg)对乳清蛋白质浓缩(WPC)重组及牛乳中乳清蛋白质的影响。压力处理β-lg溶液不同扫描热量测定(DSC)温谱图显示,有大量焓减少,这一点暗示分子结构打开能力的丧失(Dumay et al., 1994)。圆二色性谱(Iametti et al., 1997)指出,那些三色结构丧失成分的蛋白质含量较低(大概为10%)。压力可引起β-lg二聚物分裂,当缺省硫醇试剂(二硫基[2,4-硝基苯甲酸盐]),可形成稳定的单聚物。极低的压力可使单聚物释放,如果β-lg在150MPa压力下接受处理,β-lg分裂现象具有可逆性。经10℃/20小时/标准大气压处理,硫基会发生缓慢下降的趋势(Moller et al., 1998)。在较高压力的条件下,β-lg会形成各种络合体可溶性聚合物。某些聚合物为非共价的,但50%多的聚合物为二硫化物-链接低聚物(Funtenberger et al., 1997)。因为每摩尔β-lg仅含有一个自由SH基,低聚物的形成涉及到SH/S-S的互换作用。聚合是伴随压力处理时间的延长而增强的,而分子间二硫化物键联的形成与时间相关(Funtenberger et al., 1997)。变性及聚合程度要受环境条件的影响,诸如蛋白质浓度、pH、钙的参与(Funtenberger et al., 1995; Van Camp et al., 1997)。压力并不能使
α-la变性(Law et al., 1998),尽管α-la可承受SH/S-S间的互换作用而与β-lg聚合。
    当脱脂乳接受压力处理时,β-lg可能形成分子间二硫化物与К-酪蛋白键联(与延长加热的反作用相似)。 压力处理后,在pH值为4.5的情况下,β-lg被分离出而成为酪蛋白成分;乳清干酪的蛋白质含量有所减少。观察结果表明,在β-lg和酪蛋白胶态离子间可能存在交互作用。然而,在pH值为4.5的情况下,变性乳清蛋白质可能相互分离沉淀,同时聚合体可能被收集在干酪细胞间质中。López-Fandiňo et al.(1997)试验研究了压力处理的脱脂乳及蛋白质混合物,但他并未发现β-lg-К-酪蛋白络合体形成的间接迹象。蛋白质从压力处理过的、pH值为4.6的山羊奶(含有大量的聚合物不能在还原的条件下通过十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶体电泳测量<SDS-PAGE>)中沉淀出来。2-巯基乙醇减少及SDS-PAGE显示,这些沉淀物包含乳清蛋白质和К-酪蛋白(Felipe et al., 1997)。López-Fandiňo et al.(1998)借助毛细管电泳法,结果显示压力处理可导致可溶性蛋白质和胶态离子蛋白质之间的重组。他们在300MPa/30-min条件处理后,借助超速离心法研究了颗粒状物及上层清液的成分。
    非沉淀个体酪蛋白数量与每摩尔可键联胶质磷酸钙的磷酸酯数量相关。牛奶中的次序分别为β-酪蛋白、К-酪蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白。借助低-速、高-速超速离心法,分析压力处理过的山羊奶中非沉淀蛋白质(Law et al., 1998)。牛奶在20℃的温度下处理时,迅速增压可使β-lg的含量直线下降。若缓慢增压,可发现保留在上层清液中的个体酪蛋白数量直线上升(除αs2-酪蛋白外,在300MPa压力时,αs2-酪蛋白数量会缓慢上升)。


    高压下的牛乳蛋白质行为:一种假设
    升高的温度容易使牛乳蛋白质产生疏水交互作用;而增强的压力却破坏掉了这种疏水交互作用。压力并不能影响共价键、氢键,但却可以影响双硫键和离子对。基于上面所描述的牛乳蛋白质对压力处理的反应、及胶态离子结构模式,我们有可能提出在压力处理期间和处理后等一系列辅助处理程序。当低温牛奶在≥300MPa的条件下接受加压处理时,会发现它的疏水交互作用迅速分离。结果胶态离子的完整性也被破坏掉了;К-酪蛋白、β-酪蛋白(与胶态离子粘合,除疏水交互作用的К-酪蛋白、β-酪蛋白)变为血浆状态。由胶质磷酸钙黏着的小团α-酪蛋白可能也被释放了。β-lg迅速分解为单节显性的形式。这种分离形成的氢硫基组具有活性,并可形成双硫键/或催化二硫化物重组。这个变化过程较慢,与时间相关(Funtenberger et al., 1997)。在热牛奶中,这种变化过程可导致在胶态离子表面β-lg和К-酪蛋白间络合物的形成。在加压的牛奶中,科研人员发现β-lg可能与К-酪蛋白交互作用,或与其他双硫丙氨酸蛋白质(蛋白质为胶态离子碎片或单体蛋白质)交互作用。在卸压的情况下,如激光透射法中的变化所示:疏水交互作用会有迅速的重组(Kromkamp et al., 1996)。这些重组的胶态离子合成物及表面特性与未处理牛乳胶态离子或加热牛乳胶态离子不同。通过免疫标记法显示的未处理脱脂乳、加热处理脱脂乳、压力处理脱脂乳中变性β-lg的分布。在未处理(巴氏杀菌)牛奶中,免疫标记指出仅有少数β-lg变性;黄金色微粒独立于胶态离子。在加热处理的牛奶中,有大量的β-lg发生变性,并与胶态离子表面结合。在压力处理的牛奶中,则产生大量不同种类的异合体,包括β-lg聚合体、β-lg与胶态离子粘合/或包含在胶态离子中、包含在β-lg聚合体中的胶态离子。


    压力处理牛奶中产生的酸性凝胶体
    提高酸奶制造中牛乳蛋白质的含量可改善酸奶的结构特性。要使牛乳蛋白质的含量提高,可通过超滤作用或蒸发作用,浓缩液体牛奶使其达到所需的固态含量。把用于制作酸奶的牛奶中加入额外的脱脂乳粉或WPC式蛋白质而提高牛乳蛋白质的含量。这种富含蛋白质牛乳在高于80℃的温度下加热(或90℃/10-min)而使乳清蛋白质变性。然后加入乳酸菌,保存(42℃或44℃)几个小时使pH值和凝胶化降低。
    为了延长加热时间,可在制作酸奶之前加压这种混合牛奶(在牛奶中加入额外的脱脂乳粉或WPC式蛋白质)。胶态离子的破坏以及乳清蛋白质变性模式的不同说明,压力处理的牛奶要比加热处理的牛奶有明显不同。
   表明压力处理在25℃的条件下对胶态离子结构的影响、及颜色参数的不同。胶态离子的结构具有活性,较易受环境改变的影响。升温(43℃)压力处理脱脂乳可引起胶态离子破坏形成球状微粒,比原始胶态离子体积要小。这可导致脱脂乳形态的改变。Neets et al.(2000a)指出,L*、a*、b*的变化发生在对脱脂乳加热及酸化过程中。升高的温度可导致L*、a*大幅度上涨,即为散射系数,与电子显微镜显示的小体积分散胶态离子重组相一致。酸化过程中,颜色参数的改变导致了酸奶凝胶体(从压力处理的牛奶中获得)形态的凝结。尽管酸奶形成的最后阶段里颜色参数具有相似性,但这些凝胶体的流变性和微观结构却有显著的不同。
    指出酸奶凝胶体发酵阶段储存(G’)和损耗模量(G’’)的改变。在压力处理的牛奶中样品,凝胶现象开始得很迅速。冷却到4℃酸奶凝胶体的终值G’为相应热处理牛奶样品终值G’的三倍。这些结论表明,有越来越多的粒子参与了粒子与粒子间的交互作用。然而,这些交互作用形成的凝胶体与热处理形成的牛奶凝胶体存在结构上的差异。
    为加热牛奶凝胶体中分离的胶态离子被聚合状态,胶态离子间存在较大的距离,并呈现错综复杂的分布排列。免疫标记显示,β-lg中含有丰富的此凝胶体(Needs et al., 2000a)。压力处理过的牛乳中凝胶体,在胶态离子与胶态离子间存在直接的联系。若这种胶态离子外形发生较大的变化,它就会变得易脆、无黏着力(与加热处理牛乳中凝胶体比较)。这些凝胶体扫描电子显微图(图10-8)揭示,和压力处理牛乳凝胶体相比,热处理牛乳凝胶体有较密集的网状结构,胶态离子与胶态离子之间存在较小的空隙。这些微观结构的差别显示了凝胶体强度的差别。
    压力处理牛奶所产生的凝胶体/压力-设置WPC凝胶体与热处理所产生的凝胶体相比较,存在不同的结构差异、及流变特性。利用高压生产不同结构凝胶体的这种潜力将有待进一步研究,而使此技术更好的应用到乳制品行业。

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