鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂疫苗的研究

鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂疫苗的研究

张安国¹   贾培起²   贺守红¹   王银娟¹   高晶晶¹

（1.天津农学院动物科学系   300384，2.天津市华泰森森生物工程技术有限公司   300100）

鸡新城疫、禽流感是危害养鸡业发展的两种重要的病毒性传染病，广泛流行于包括我国在内的世界各地，给养鸡业造成了巨大的经济损失，严重的影响着养鸡业的发展。目前对禽流感主要应用特定血清型毒株研制的灭活疫苗进行预防和控制，在鸡新城疫的免疫防治方面，现使用最多的是几种弱毒疫苗，但弱毒疫苗不易保存，而且易受母源抗体干扰，免疫效果不稳定，所以很多鸡场也常采用灭活疫苗进行预防。

在灭活疫苗研制过程中，病毒的灭活长期以来主要采用热力、化学处理等方法，但这些技术都存在一些弊端，而超高压技术在这方面则具有广阔的发展前景。用超高压技术处理的病毒可以提供一个完整的病毒颗粒，这种颗粒不仅丧失了原来的感染性，且保持了原病毒的免疫原性，可以诱导机体产生与原病毒相同的免疫反应，所以超高压技术在疫苗制备方面有极大的应用潜力。自然界中的病毒从结构组成方面可分为无包膜病毒和有包膜病毒，无包膜病毒的耐高压性较强，故人们研究较多的是有包膜病毒。对于有包膜病毒的热力致死主要是由于病毒包膜结构破坏、酶失活、蛋白变性、DNA或RNA断裂损伤等原因造成。而其静水高压致死病毒则主要由于超高压可引起病毒膜结构内部非共价键结合的破坏，膜衣壳蛋白亚单位之间解体。这种解体在减压以后又有可逆性重组，但由于病毒颗粒蛋白成分的复杂性，这种重组不能恢复如初，而使膜衣壳蛋白空间结构发生变化，引起膜构象转换，生物活性改变。病毒颗粒丧失感染性，同时又由于超高压并不破坏共价键，作为抗原的单个亚单位不破坏，故其免疫原性不变。Pontes等曾用电镜、光谱分析等方法检测了轮状衣壳蛋白的重组现象。Nakagaml等也曾报道，超高压可显著降低病毒颗粒对正常细胞的吸附能力，使其丧失感染性。总之，超高压可以通过多种机制致死病毒，而在其导致病毒感染性丧失的同时，病毒免疫原性保持不变。Jurkiewicz等也提出在灭话病毒的同时，病毒基因组不变，故不引起可遗传的变异。

自1895年Rogar等首次报道了超高压可以杀死微生物以来^[1]，应用超高压技术的研究报道在国外陆续出现。超高压技术作为一种有效的物理灭菌手段已成功地应用于生物工程的多个领域，如转化大分子结构、修饰酶活性、改变微生物代谢及基因表达^[2]。尤其近年来欧、日等将超高压技术应用于食品加工工业以来，它的应用领域进一步扩展^[3]。但应用超高压技术灭活病毒，研制疫苗的研究只不过几年的历史。池元斌等^[3]（2001）以250MPa的静水压力对犬瘟热病毒（CDV）处理30min之后CDV被灭活，由其制成的灭活疫苗诱导犬产生中和抗体的能力明显优于传统的幅尔马林灭活疫苗，免疫保护率达90％。电镜观察显示，经不同程度静水压力处理后的CDV粒子均发生变形，表面呈现凸起，但CDV H基因部分片段的RT-PCR扩增结果揭示，高达510 MPa的静水压力作用30 min也未能使其基因片段受到破坏。夏咸柱等^[4]（2000）用静水压高压灭活的方法对CDV进行灭话，并加入蜂胶佐剂制备犬瘟热病毒高压灭活疫苗。用此灭活疫苗免疫接种CDV易感犬，同时以用福尔马林灭活的犬瘟热病毒灭活疫苗为对照，检测结果表明犬瘟热病毒高压灭活疫苗安全、可靠，其诱导试验犬所产生中和抗体的能力明显高于该病毒的福尔马林灭活苗，临床应用证明该疫苗对犬的保护率达89％。余春等^[5]（2000）使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒（CCV）蜂胶佐剂灭活苗。将此灭活苗免疫接种易感犬，同时以CCV甲醛灭活苗作对比试验。结果表明CCV压力灭活苗安全可靠，其免疫试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗，临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒性肠炎的发生与流行。应用超高静水压技术，研制其他家畜和家禽疫苗的研究目前尚未见报道。

基于超高压灭活病毒的诸多优点，也为了减少疫苗免疫次数和鸡群应激，减少免疫费用，提高免疫效果，本研究旨在试验探讨利用超高静水压技术，对鸡新城疫、禽流感病毒进行超高静水压灭活，将两种病毒超高压灭活抗原混合制成鸡新城疫-禽流感二联超高静水压灭活疫苗，用其对试验鸡群进行免疫，测定免疫后鸡群不同时期血清抗体效价，并以常规灭活（甲醛）二联苗作对照，观察二这免疫效果之差异。本研究将为养鸡业防治此类传染病提供一种经济有效方法，为天津市华泰森森生物工程技术有限公司与清华大学智能技术与系统国家重点实验室联合研制超高静水压生物处理机的开发使用及利用该技术研制相关疫苗提供依据。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器   超高压生物处理试验机，型号HPB.A2-600/0.4，由天津市华泰森森生物工程技术有限公司与清华大学智能技术与系统国家重点实验室联合研制。净化工作台、高压灭菌器、干热灭菌器、恒温培养箱、细菌滤器、胶体磨、离心机、微型震荡器、微量移液器、微量试验板等天津农学院动物科学系动物预防医学实验室常规仪器。

1.1.2 制苗病毒株 新城疫病毒La sota株、禽流感病毒H9株，为天津农学院动物科学系动物预防医学实验室鉴定保存毒种。

1.1.3 试验鸡胚 由天津市兴华养鸡场购买，鸡胚健康，相关抗体效价（测定结果）较低。

1.1.4 试验用鸡   由天津市兴华养鸡场购买，品种为双A罗曼肉杂，32日龄，健康，相关抗体效价（测定结果）较低。

1.1.5 试验试剂   7号白油、司班-80、吐温-80、甲醛、硬脂酸铝等试剂，分别由化学试剂公司和天津红岩化工厂购买，质量、纯度符合制苗要求。

1.2 病毒抗原的制备

1.2.1 病毒活化   将各病毒种毒无菌稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，培养72~96小时，冷冻，收取病毒液分装保存，测定病毒效价（用HA法或测EID50）。

1.2.2 病毒繁殖   将病毒液无菌稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，培养72~96小时，冷冻，收取病毒液，分装保存，测定病毒效价（用HA法或测EID50）。

1.2.3 病毒的灭活

1.2.3.1 病毒超高静水压灭活   将各无菌病毒液分装，新城疫病毒（NDV）La sota株、禽流感病毒（AIV ）H9株病毒液分别在300Mpa、500Mpa 超高静水压力下分别保压灭活30min。

1.2.3.2 病毒的甲醛灭活   将各无菌病毒液分装，新城疫病毒La sota株、禽流感病毒H9株病毒液分别按0.2%加入甲醛溶液，混合均匀，37℃灭活24h。

1.2.4 病毒灭活效果测定 将各灭活病毒液，无菌1:10倍稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，37.5°C培养72~96小时，冷冻，观察胚体病变，收取尿囊液，分装保存，检测病毒（用HA法或测EID50）。

1.3 二联油苗的制备

1.3.1 佐剂的制备   由7号白油（94%）、司班-80（6%）和硬脂酸铝（占总量2%）按资料配制油佐剂。

1.3.2 二联苗配制及乳化   将NDV、AIV灭活毒液，依毒价按比例（约1:1）混合，加入灭菌的吐温-80（2%）、硫柳汞钠溶液（1/万）等搅拌均匀为水相，然后将水相缓慢加入由7号白油、司班-80和硬脂酸铝配制的油相中（水相油相比约1:2），用搅拌器和胶体磨充分混合乳化，制成油包水型超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂苗和甲醛灭活ND-AI二联油乳剂苗。分装，密封、贴签、备用。

1.3.3 疫苗的物理性测试   乳剂类型：采用滴于冷水表现法；稳定性：采用离心加速分层法；分散相粒度：用显微镜测微尺测量；粘稠度：用口径1.2mm的1ml吸管垂直自然流出0.4ml所需时间表示。

1.3.4 疫苗的安全性测试

1.3.4.1 无苗检验   将灭活毒液和制成的油乳剂苗，适当稀释后接种普通肉汤、厌氧肉汤及普通琼脂、血液琼脂等培养基，置37°C培养7天，观察有无微生物生长。

1.3.4.1 疫苗安全性检查   按免疫剂量的4倍（每只2.0ml），用两种疫苗各肌肉和皮下注射试验鸡4只，观察20天，视有无临床反应和注射局部的硬肿和溃烂现象。

1.4 疫苗免疫试验

1.4.1 免疫分组   将60只30日龄健康鸡分为3组，每组20只。第1组，肌肉注射超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂苗0.5 ml/只；第2组，肌肉注射甲醛灭活ND-AI二联油乳剂苗0.5ml/只；第3组，用La Sota—H₁₂₀二联弱毒苗同时免，与免后30天用La Sota—H₅₂二联弱毒苗再次免疫。IBD疫苗已常按规进行了免疫。

1.4.2 免疫抗体测定   于免疫当日（0天）和免后7、15、20、60、80、100、120天各组分别随机抽样采血，测定血清NDV、AIV的HI抗体效价（测定两个试验免疫组及对照组鸡体两种抗体）。

2 结果

2.1 病毒增殖与灭活

2.1.1 病毒液效价   将NDV、AIV种毒无菌稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，培养72~96小时，冷冻，收取病毒液分装保存。测得病毒HA效价：NDV为2^10.5，AIV为2^9.5。

2.1.2 病毒灭活效果

2.1.2.1 病毒超高静水压灭活效果   将2种超高静水压灭活的病毒液，分别无菌1:10倍稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，37.5°C培养72~96小时，冷冻，观察胚体病变，收取尿囊液，分装保存，检测病毒效价。结果2组胚体均未见任何病变，2组鸡胚尿囊液HA均为阴性。说明超高静水压处理的病毒液，病毒灭活彻底。

2.1.2.2 病毒的甲醛灭活效果   将甲醛灭活病毒液，无菌1:10倍稀释后接种10日龄鸡胚，每胚0.2ml，37.5°C培养72~96小时，冷冻，观察胚体病变，收取尿囊液，分装保存，检测病毒效价。结果2组胚体均未见任何病变，2组鸡胚尿囊液HA均为阴性。说明甲醛处理的病毒液，病毒灭活彻底。

2.2 二联油苗的物理形状和安全性

2.2.1 疫苗的物理性状

乳剂类型：采用滴于冷水表现法，2种疫苗滴于冷水表面均呈规则圆形；稳定性：采用离心加速分层法，2种疫苗经4000rpm离心15min，均未出现油水分层情况；分散相粒度：用显微镜测微尺测量，2种疫苗的分散相液体粒度在0.5-1.0μm，较均匀；粘稠度：用口径1.2mm的1ml吸管垂直自然流出0.4ml所需时间在8~13秒。

2.2.2 疫苗的安全性

2.2.2.1 无苗检验   将灭活毒液和制成的油乳剂苗，适当稀释后接种普通肉汤、厌氧肉汤及普通琼脂、血液琼脂等培养基，置37°C培养7天，观察结果：所有接种的培养基均无任何微生物生长。

2.2.2.2 疫苗安全性检查   按免疫剂量的4倍（每只2.0ml），用两种疫苗各肌肉和皮下注射试验鸡4只，观察20天。结果：没有发现接种鸡有临床反应和注射局部的硬肿和溃烂现象。

2.3 疫苗免疫效果

2.3.1试验鸡抗体水平表   见表1。

表1   实验鸡HI抗体测定结果                                         （GMP Log2）

  注：表1中2个试验组0天及对照组0~120天测定的AIV HI抗体效价均≤2。

    从表1可以看出，试验期间测得的NDV、AIV HI抗体效价，静压灭活疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组的2种抗体的效价均高于对照组的相应值（p<0.01），说明试验组2种疫苗都有明显的免疫效果。

2.3.2试验鸡抗体水平图   见图1。

    由图1可以看出，静压灭活疫苗免疫组的NDV、AIV HI抗体效价明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值，说明静压灭活疫苗的免疫效果优于甲醛灭活疫苗。

2.3.3试验鸡同种抗体水平比较   见表2、3。

   表2   2种疫苗NDV HI抗体效价比较                                    （GMP Log2）

    由表2可以看出，在试验测定的7~120天中，静压灭活疫苗免疫组的NDV HI抗体效价在不同测定时期，均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值（p<0.01），平均高出1.14 Log2。

表3   2种疫苗AIV HI抗体效价比较                                     （GMP Log2）

由表3可以看出，在试验测定的7~120天中，静压灭活疫苗免疫组的AIV HI抗体效价在不同测定时期，也均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值（p<0.01），平均高出1.10 Log2。

从表2、3还可以看出，超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗与甲醛灭活ND-AI二联油乳剂疫苗相比，抗体产生速度相当，但超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗免疫的试验鸡的抗体蜂值高、维持性好、衰减较慢。

3 小结与讨论

3.1 小结

3.1.1 病毒增殖与灭活

3.1.1.1 病毒液效价   试验中繁殖的NDV、AIV 2种病毒液的HA效价（抗原效价）较高，分别达2^10.5、2^9.5，符合疫苗制备要求。

3.1.1.2 病毒灭活效果   超高静水压灭活的病毒液和甲醛灭活病毒液（抗原液），经活性检测试验证明2种处理方法，均可达到病毒灭活的目的，病毒灭活彻底。

3.1.2 二联油苗的物理形状和安全性

3.1.2.1 疫苗的物理性状   试验中制备的2种油乳剂灭活苗乳，经物理性状测试证明，均具有良好的油包水剂型特点，性质稳定，不易分层，粘稠性合理，通针性良好。符合油乳剂疫苗要求。

3.1.2.2 疫苗的安全性   对灭2种活毒液和2种油乳剂苗，经无菌检验证明均不含任何微生物。用4倍免疫剂量（每只2.0ml）的2种疫苗，肌肉和皮下注射试验鸡，在观察观察期内，接种鸡只没有发生任何不良反应。证明所制的2种疫苗均具有较好的安全性。

3.1.3 疫苗免疫效果

3.1.3.1试验鸡抗体水平   试验期间，由测得NDV、AIV HI抗体效价分析表明，静压灭活疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组的2种抗体的效价均高于对照组的相应值（p<0.01），说明2种疫苗都有明显的免疫效果。而且可以看出静压灭活疫苗免疫组的NDV、AIV HI抗体效价分别为8.57 Log2和8.03 Log2，明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值7.43 Log2和6.93 Log2（p<0.01），说明静压灭活疫苗的免疫效果优于甲醛灭活疫苗。

3.1.3.2试验鸡同种抗体水平比较   经比较分析证明，在免疫测定期间，静压灭活疫苗免疫组的NDV HI抗体效价在不同测定时期，均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值（p<0.01），平均高出1.14 Log2。静压灭活疫苗免疫组的AIV HI抗体效价在不同测定时期，也均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值（p<0.01），平均高出1.10 Log2。

3.2 讨论

3.2.1 病毒超高静水压灭活条件的确定   NDV、AIV 2种病毒对超高静水压的耐受性有一定的差异，我们通过试验确定了NDV、AIV病毒临界灭活条件，NDV的临界灭活条件为450 Mpa 30min，而AIV的临界灭活条件为250 Mpa   30min。但为了确保安全，NDV、AIV病毒液分别选用500Mpa、300Mpa超高静水压下分别保压灭活30min处理。试验证明该灭活条件下病毒灭活彻底。

3.2.2抗原病毒两种灭活方法的差异   超高静水压处理是一种低温高压物理处理方法，可导致病毒囊膜上的蛋白亚单位组合形式发生改变使病毒失去感染性，但不影响其抗原结构，而且有报道指出，由于病毒囊膜结构的物理性改变，还可使病毒的部分膜内抗原得以暴露，使其抗原性增强。而甲醛灭活法，是一种传统的抗原病毒灭活方法，这种方法是一种化学灭活方法，其灭活原理是通过醛类的还原作用和醛化作用使病毒蛋白变性，进而使病毒灭活。对制备疫苗的抗原灭活而言，甲醛灭活具有两大缺陷：首先甲醛灭活可降低或影响病毒抗原的抗原性；其次是甲醛是一种潜在的致癌物质，对动物健康不利，更重要的是甲醛疫苗用于食用动物，将对人类健康产生潜在危害。

4结论

用一定压力的超高静水压，保压一定时间，对NDV、AIV病毒液进行超高压冷处理，可使2种病毒完全灭活，用灭活病毒抗原制备的超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗安全、稳定。用灭活病毒抗原制备的超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗与甲醛灭活的ND-AI二联油乳剂疫苗相比，在抗原含量相同的情况下，前者免疫效果更好，前者免疫的试验鸡血清NDV、AIV HI抗体效价较后者分别高出1.14 Log2和1.10 Log2（p<0.01）。而且实验还证明超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗与甲醛灭活ND-AI二联油乳剂疫苗相比，抗体产生速度相当，但超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗免疫的试验组鸡的抗体维持性好，衰减较慢。

参考文献

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