综述1： 国内外超高压血浆净化治疗的发展概况发表时间：2020-09-14 12:46 综述1： 国内外超高压血浆净化治疗的发展概况 贾培起 1899年美国物理学家 Berd Hite发表了第一篇论文《压力对牛奶保存的影响》；1914年美国物理学家、诺贝尔奖金获得者Percy Williams Bridgman发现高压能使蛋白质变性；1986年日本京都大学林力丸教授发表超高压加工食品的论文，揭开了超高压产业化应用的序幕；1990年日本梅迪亚株式会社研制出世界上第一个超高压食品——超高压果酱，投入市场引起世界关注。至此超高压加工技术从实验室到产业化整整跨过了一个世纪。 由于超高压技术对生物材料加工工艺的独特优势，科学家们开始关注超高压技术在医学领域的应用。国外走在中国的前面，取得了一系列成果，这为我们的临床应用提供了很多可贵的经验和成果。 1. 国外的发展概况 1.1 日本对艾滋病血浆HIV病毒的高压灭活 1996年重久 保博士等专家对超高压灭活人体血浆中的病毒进行了研究,并且发表了论文《Inactivation of HIV in blood plasma by high hydrostatic pressure》（高静水压灭活血浆中的HIV）[1]。 他们用施加超高压的方法对血浆中的人巨细胞病毒HCMV（Huamn cytomegalovirus）、单纯疱疹病毒HSV-1（herpes simplex virus）、人类免疫缺陷病毒（HIV-1）进行了灭活研究，结果如图1、2。
图1.高静水压（HHP）对单纯疱疹病毒类型（HSV-1）和人巨细胞病毒（HCMV）的影响。将病毒悬浮液在25℃下在100至600MPa加压10分钟，测定HSV-1和HCMV的感染性。
图2.高静水压（HHP）对1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的影响。 将含有10％胎牛血清的病毒（IIIB病毒）悬浮液在100至500 MPa下进行HHP处理10分钟（A），并在25℃进行10至1,000分钟（B）。 在MT-4细胞中评估了HIV-1的感染滴度。 结果表明，较低的HHP就会导致血小板的溶血和变形，但是相对较高的HHP不会使血浆成分（例如球蛋白，凝血酶，抗凝血酶或IX因子）失活。他们将超高压净化血浆与服用逆转录酶抑制剂治疗进行了对比，后者在两天内，血液中的HIV减少，CD4 +淋巴细胞迅速增加。然而之后耐药性突变体的增加导致艾滋病毒增加，而CD4 +淋巴细胞减少。 HHP治疗的体外应用克服了HIV的突变，可以明显看出，HHP处理是适用于生产无病毒血浆和血浆衍生产品的有前途的方法。 1997年重久 保博士等专家再次发表《高圧処理がヒト免疫不全症不全ウイルス（HIV）および血液細胞成分に及ばす影響》[2]。其中对血浆中HIV的不同菌株进行了高压灭活实验。除了研究ⅢB株以外，还对AIDS患者分离的KK-1株和HIV携带者分离的KK-2株进行了研究（图3）。ⅢB株的RT活性在400MPa以上压力下几乎全部失活，KK-1和KK-2的活性残存。KK-2活性在500MPa残存57%，在550MPa残存20%。
图3 高压对各种HIV-1病毒株的影响 病毒IIIB株（■）， AIDS患者分离的KK-1株（●），和HIV携带者分离的KK-2株（▲）。悬浮在10%的胎牛血清中，25℃，高压100-500MPa，10min。 他们通过透射型电子显微镜观察，其结果是500MPa、10分钟高压处理HIV（ⅢB株）的包膜构造已经断裂（图4-B所示）还观察到其内部质液已经泄漏（图4 c所示）。
图4 电子显微镜观察HIV（ⅢB株）粒子 A：没有处理；B、C：25℃、500MPa高压处理10min 另外，他们观察了高压处理HIV的逆转录酶（RT）出现的失活现象。从图5可以观察到ⅢB株的RT活性与感染力的变化， RT活性与感染力有同步降低的倾向。换言之，ⅢB株的RT活性在400MPa以上压力下几乎全部失活，KK-1和KK-2的活性残存。KK-2活性在500MPa残存57%，在550MPa残存20%。
图5 高压对HIV-1病毒ⅢB株感染滴度（■）和转录酶（●）活性的影响 1.2 血浆净化的冻胀加压法 2000年Toru Otake等在 “国际第一届高压生物科学与技术论坛（东京）”发表了论文《Mechanism of Inactivation of HIV-1 by the Freeze Pressure Generation Method(FPGM)》（冻结压力产生法（FPGM）灭活HIV-1的机理） 他们将血浆密封在缸体腔内，通过冻结引起膨胀所产生的高压（冻结压力生成方法FPGM），对细菌和HIV-1进行灭活。在-10℃（100mpa）处理后，病毒感染滴度降至约1/100，在-20℃（200 MPa）或-30℃（250 MPa）处理后，病毒感染滴度降至检测极限以下。在20℃或30℃时，逆转录酶的活性下降至约1/10。此外，他们证实FPGM事病毒丧失了结合细胞表面的能力。病毒失活的机制可能涉及病毒酶的破坏和病毒包膜蛋白的变化。
图6冷冻压力产生方法对HIV-1感染性的影响，■细菌，□HIV-1 1.3 压力脉冲的血浆净化 2000年S.Dusing等在“国际第一届高压生物科学与技术论坛（东京）”发表了另一篇灭活血浆病毒的论文《Inactivation of viruses in plasma by cycled pulses of high pressure》（压力脉冲循环灭活人体血浆的病毒）。 他们通过PCT经验确定病毒灭活所需的压力（<570 MPa）温度（-60C至+ 60C）以及加压持续时间和次数，以优化病毒灭活和保留治疗性蛋白的功能活性）。为了满足监管机构对血浆中病毒灭活的要求，PCT技术的目标包括至少4个对数的包膜病毒（例如HIV，乙型肝炎，丙型肝炎），至少4 -6个对数的非包膜病毒（例如人细小病毒）灭活并保持完整性。 当在20℃下承受超过400 MPa的三个重复压力循环时，MS2噬菌体迅速失活，而在500-540 MPa下大约有4对数的MS2灭活（图7）。高压下的循环持续时间为60秒，环境压力下的循环持续时间为300秒。在这些压力条件下，Ⅷ因子活性的范围从在400MPa下的控制的53％到在540MPa下的控制的32％。保留Ⅷ活性的MS2灭活的最适条件为约520 MPa。 为了评估压力脉动的影响，将血浆样品在20℃和540MPa下保持的时间在15至240秒之间变化，同时将三个周期中的每个周期在环境压力下的时间保持在300秒。压力脉冲有利于Ⅷ因子的保留，而每个周期中高压施加的持续时间并未明显影响MS2的失活（数据未显示）。试图通过进一步减少500 MPa的循环时间来增加Ⅷ因子活性的保留，可以有效地通过三个I秒脉冲来保留82％的Ⅷ因子活性（图8）。但是，在高压下少于10秒的循环时间会导致MS2失活的明显减少。从图10可以看出，脉冲循环加压（PCT）比静态加压灭病毒的效果好，同样条件可以适当降低压力，从而降低对Ⅷ因子的损害。同时，工作温度也会影响灭活的效果。
图7 PCT技术灭活MS2噬菌体及对Ⅷ因子的影响。
图8 MS2失活和相对于高压脉冲长度的Ⅷ因子活性。
图9. PCT介导的HIV灭活与压力的关系。
图10温度对540 MPa的PPV循环加压和静态加压对失活的影响。 1.4 血浆中钩端螺旋体的高压灭活 巴西Carla Cilene MatosSilvaa等2001年发表了《Effects of hydrostatic pressure on the Leptospira interrogans: high immunogenicity of the pressure-inactivated serovar hardjo》（静水压力对钩端螺旋体的影响：压力灭活血清型哈德霍的高免疫原性）[5]。 钩端螺旋体血清型哈德霍氏菌的Hardjoprajitno菌株受到不同的静水压力。当用200MPa处理钩端螺旋体60分钟时，发生完全灭活。 电子显微镜显示外膜错位，螺旋形部分丢失和轴向细丝从加压钩端螺旋体的细胞质圆柱体中挤出。将经过压力处理的钩端螺旋体接种到兔子中后，它们具有高度的免疫原性。这些动物的血清在显微镜下的血清凝集反应中的效价为2048。荧光测量表明，对钩端螺旋体的压力作用可能是由对膜蛋白成分的扰动引起的，从而允许荧光探针双（8-苯胺基萘-1-磺酸盐）（Bis-ANS）结合。这是首次使用静水压力用病原菌失活制取苗的报道。 1.5 猪血浆微生物的高压净化 西班牙D. Pares2001年发表了《High Hydrostatic Pressure as a Method to Reduce Microbial Contamination of Porcine Blood Plasma》（高静水压作为减少猪血浆中微生物污染的方法）[6] 他评价了高静水压力作为生产具有足够微生物稳定性而不影响其功能特性的猪血浆的替代方法的适用性。高压对血浆微生物的影响高度依赖于加工温度。 在5℃下以450 MPa进行的15分钟处理导致微生物数量减少了约90％，残存的生长能力降低了20-50％。 在25℃和40℃时，效率分别提高到降低值99.82和99.97％。生长能力的降低在25℃时约为50％，在40℃时高达80％。 最有效的处理（450 MPa，在40℃下持续15分钟）并未对猪血浆中的热诱导凝胶的功能特性产生明显的负面影响。
图11.在5、25和40℃下450 MPa加压15分钟的血浆对照和血浆加压后的微生物数。 具有相同字母的样本没有显着差异（P = 0.05）。
图12.在血浆控制下，在5、25和40 C下以450 MPa加压15分钟的血浆中，微生物在37°C下的生长曲线。 1.6 牛血清腹泻病毒的高压灭活 土耳其Cagatay Ceylan等2001年在《Veterinary microbiology》刊物上发表论文《Biophysical and microbiological study of high hydrostatic pressure inactivation of Bovine Viral Diarrheavirus type 1 on serum.》（血清中1型牛腹泻病毒高静水压灭活的生物物理和微生物学研究）[7]. 他们在25℃和132和220 MPa的压力下，于5分钟内研究了施加高静水压力对胎牛血清成分和模型微生物（牛病毒性腹泻病毒1型NADL菌株）的影响。 对于未经处理和经HHP处理的样品，发现蛋白质二级结构均不受酰胺I区域上人工神经网络的影响。 用HHP处理和对照样品的FTIR光谱研究表明，指纹区域（1500-900 cm 1）中某些条带的强度发生了变化，这些变化主要是由脂质引起的，脂质被认为是脂蛋白结构的变化所致。 在220 MPa HHP处理后，该病毒株完全丧失了感染力。 这些结果表明，HHP可成功用于灭活瘟病毒，同时保持血清和血清产物的结构和功能特性不受影响。
图13.牛病毒性腹泻病毒类型在25°C下5分钟的HHP稳定性。 1.7 人体血浆金黄色葡萄球菌的高压灭活 法国Nolwennig Rivalain等于2012年在《New BIOTECHNOLOGY》上发表论文《High hydrostatic pressure treatment for the inactivation of Staphylococcus aureus in human blood plasma》（高静水压灭活人血浆中金黄色葡萄球菌）[8]。 为了确保包含容易破坏的有效治疗成分的药品的安全性，需要在最低压力值下开发新的方法以保持其治疗性能。他们评估表征高压处理的工艺参数（例如增压速率和施压方式）对病原体灭活的影响，尤其是确定这些参数如何帮助降低达到相同灭活水平所需的压力值。 他们评估了这些物理参数对金黄色葡萄球菌ATCC 6538失活的影响，选择人血浆作为悬浮介质是因为其在输血领域中的生理重要性。结果表明，所有选定参数的优化都可能在低至200 MPa的压力水平下导致较高的灭活水平，从而突显了这些参数之间的一些协同作用，在适合的条件下，初始细菌种群完全失活。
图14 在各种高压模式下，通过各种高压模式处理各种高压水后，金黄色葡萄球菌在悬浮液中的存活情况有以下几种应用模式：1个周期10分钟（灰色条），5个周期5分钟（黑色条）或20个30个周期（白色） （PR ＝ 3.3MPa s-1，T ＝ 25℃）。
图15 在不同温度，25°C（灰色条形）或-5°C（黑色条形）（PR = 3.3 MPa s-1，AM = 5个周期，2个温度）下以较高的压力值进行各种HHP处理后，人血浆中金黄色葡萄球菌在悬浮液中的存活 分钟）。 2. 国内的发展情况 中国国内开展超高压治疗研究比较晚，但是在人体血浆净化的临床治疗方面迈开了第一步。天津华泰森淼公司与国内各个医疗机构合作，积极进行这方面的研究，并努力推动临床治疗的应用。 2.1 病毒灭活与高压处理血浆的分别实验研究 天津华泰森淼进入超高压技术领域之初就重视超高压在医学领域的应用，因为它关乎人类的生命健康，具备更高的社会价值。 2004年，公司研制成功第一台一体化超高压设备，与清华大学合作，完成了国家863项目“移动式危险传染病应急诊疗病房系统”中的子课题“超高压生物处理技术及设备”（课题编号2003AA421050-2），并获得了发明专利。同时，分别与天津农学院合作，进行超高压灭活病毒的研究；与天津血液中心合作，进行超高压处理血浆的研究。 农学院张安国教授等的实验表明： 1）新城疫病La sota株（NDVL）和鸡传染性支气管炎H52株（IBVH52）的灭活条件均为450Mpa50 min及以上。 2）禽流感病毒H5株（AIVH5）和H9株（AIVH9）的灭活条件是250Mpa50 min及以上。 3）鸡传染性支气管炎H52株（IBVH52）的灭活条件均为250Mpa50 min及以上。 4）鸡传染性支气管炎腺胃型株（GIBV02）灭活条件较高，为500Mpa30 min及以上[9]。 同年，与天津血液中心合作，李忠平主任对超高压处理参数进行了设计，李瑞兰医师进行检测，证明超高压处理对凝血功能影响不大，其中以200MPa的参数凝血效果最好[10]。 表1 超高压处理血浆凝血实验报告
2.2 超高压灭活血浆病毒的研究 2011年华泰森淼公司与中国军事医学科学院野战输血研究所合作，对血浆的几种病毒进行了超高压灭活研究，周锡鹏研究员等在《中国输血杂志》（2013年9月），发表了研究报告“超高压（等静水压）灭活血浆病毒的研究”。他们对PRV、VSV、Sindbis、PV1、PVV等病毒进行了350、400、500、600MPa，10-60min等不同参数的灭活实验，证明600Mpa处理10min、500Mpa处理20min、400Mpa处理60min、350Mpa处理90min可灭活PRV、PRV、VSV等3种脂包膜指示病毒灭活4lgs以上。该方法能够有效灭活的病毒是HBV和HCV的指示病毒。符合“血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则”中病毒灭活工艺有效的要求[11]。
图11 400MPa、60min处理VSV病毒电镜图 2.3 超高压灭活血浆病原体的研究 2016年中国医学科学院成都输血研究所杨春晖博士等在《PLOS ONE》发表了论文《Development of High Hydrostatic Pressure Applied in Pathogen Inactivation for Plasma》（高静水压在血浆病原体灭活中的应用）。 他们在不同压力下推入病原体接种的血浆样品检测大肠杆菌的CFU作为灭活效率的指标，选择作用因子V和VIII作为血浆模式和温度的指标，处理后监测病原体的灭活效果和血浆蛋白活性。通过实验确定了最佳处理条件：200-250MPa，在接近0℃的条件下（冰水浴）施加5×1分钟的多脉冲高压，在这种条件下，EMCC的灭活效果> 8.5log。大肠杆菌的CFU降低了7.5log，蜡状芽孢杆菌为8log，但是PPV和金黄色葡萄球菌不能被有效灭活。与未经处理的相比，X，XI，XII，纤维蛋白原，IgG，IgM保持在95％以上，因子V和VIII的活性分别保持在46-63％和77-82％[12]。
图12 通过优化的HHP处理（200/250 Mpa，5个循环1分钟，在接近0°C的温度下）进行病毒灭活的动力学，n = 3。
图13 在HHP（5个周期，1分钟）处理下凝血因子V和VIII活性的变化，n = 3。 2.4 艾滋病临床治疗的研究 2010年华泰森淼公司与开封防病中心孙锦山主任医师达成合作意向，开展自体血浆超高压净化临床治疗艾滋病的研究。 2012年，在河南省艾滋病防治办公室的支持和帮助下，李自釗主任亲自组织了项目的研究，孙锦山主任负责治疗过程的设计和指导，华泰森淼公司贾培起负责现场高压治疗设备的操作指导，在第一批4例病人治疗一个疗程后，证明临床治疗对病人是十分安全的，没有任何副作用，通过跟踪调查，其中一人显示阴性，达到痊愈的指标；三人平均病毒载量下降了95%。 2017年，孙锦山主任对另外三名病人进行了治疗，一人痊愈，二人尚待继续治疗。 实践证明“自体血浆超高压净化临床治疗”是安全有效的，它不仅针对HIV病毒，对HAV、HBV、VSV等病毒和其它致病菌都是有效的，可以逐渐扩大其应用范围[13]。 2.5 艾滋病治疗仪的研究 华泰森淼公司在高压设备发明专利的基础上，设计了适合病房和实验室的超高压仪器，体积、重量大大缩小，尺寸相当于家用的冰箱。
图14 超高压处理血浆仪器（左W1型，右L1型） 另外，为了实现连续进行血浆高压处理，提高治疗效果和速度，该公司获得了“压力循环自体血浆净化治疗仪即艾滋病治疗机”（ZL 2010 2 0692000.X）。
图15 压力循环自体血浆净化治疗仪即艾滋病治疗机工作原理图 这是类似透析机的血浆连续处理的治疗设备。其结构如图15所示：A是插入病人动脉血管的取血针头，B是插入病人静脉血管的回血针头。1是血浆单采机，该设备是采集血清，通过数字控制血泵2，输入到处理系统。超高压处理系统有两个相同的超高压处理器，二者交替工作，保证连续处理，提高治疗效率。3、4、7、8是电磁控制阀，通过程序控制协调血浆通路的启闭。5、6是压力传感器，用于测定血浆处理的压力。9、10是加压柱塞，11、12是超高压密封件，13、14是推力丝杠，15、16是减速器，17、18为步进电机,19是回血泵,20为监视器用于监视病人的动脉压、静脉压、心率，C是测量病人血压、心率的传感器。另外显示器还显示血泵、超高压处理的压力及进出血流的流量。 超高压处理是新的生物科学技术手段，鉴于它的独特的工艺特点和实际效果，一定会在医学领域被广泛地应用。除了病毒、致病菌感染的临床治疗之外，它在癌症治疗、疫苗制取、人体生物组织的制备和天然药物加工方面同样会发挥作用。
参考文献 [1] T. Shigehisaa, T. Nakagamia,. Ohnoa T. Otakeb, H. Morib, T. Kawahatab, M. Morimotob and N. Uebab，Inactivation of HIV in blood plasma by high hydrostatic pressure《High pressure bioscience and biotechnology》1996,p.273-278 [2] 重久 保，大野広志，大竹 徹，森 治代，川畑拓野，泉本洋子，大石 功 《高圧生物科学と高压技術》1997 p.45-52 [3] Toru Otake, Takuya Kawahata, Haruyo Mori, Yoko Kojima, Isao Oishi,and Kiyoshi Hayakawa《Mechanism of Inactivation of HIV-1 by the Freeze Pressure Generation Method(FPGM)》《Proceedings First International Conference on High Pressure Bioscience and Biotechnology》2000 Kyoto, Japan p361-363 [4] S.DusingC.LiJ.BehnkeM.ManakR.Schumacher《Inactivation of viruses in plasma by cycled pulses of high pressure》《Proceedings First International Conference on High Pressure Bioscience and Biotechnology》2000 Kyoto, Japan p.355-359 [5] Carla Cilene Matos Silvaa，Viveca Giongob， Andrew John George Simpsonc Elizabeth Ribeiro da Silva Camargosd，Jerson L Silvab，Matilde CotaKoury，《Effects of hydrostatic pressure on the Leptospira interrogans: high immunogenicity of the pressure-inactivated serovar hardjo》《Vaccine》Volume 19, Issues 11–12, [6] D. Pares 《High Hydrostatic Pressure as a Method to Reduce Microbial Contamination of Porcine Blood Plasma》《 Food Science and Technology International》2001,.7(2)， p117-121. [7] Ceylan Cagatay,Severcan Feride,Ozkul Aykut,Severcan Mete,Bozoglu Faruk,Taheri Nusret 《Biophysical and microbiological study of high hydrostatic pressure inactivation of Bovine Viral Diarrheavirus type 1 on serum.》《Veterinary microbiology》2001 [8] Nolwennig Rivalain,Jean Roquain,Jean-Michel Boiron,Jean-Paul Maurel,Alain Largeteau,Zoran Ivanovic,Gérard Demazeau，《High hydrostatic pressure treatment for the inactivation of Staphylococcus aureus in human blood plasma》，《New BIOTECHNOLOGY》2012. [9] 张安国，贾培起，庞运通，侯金伟，王银娟，贺守红《几种重要动物病毒超高静水压灭活试验研究报告》2004 [10] 李忠平，李瑞兰，贾培起《超高压处理对血浆凝血功能的影响实验报告》2004 [11]周锡鹏,贾培起,马平,吕丽萍,闫舫，张艳宇，肖军，邓江，康琼，许金波，《超高压（等静水压）灭活血浆病毒的研究》2013.9，p809-810 [12] Chunhui Yang1, Guohui Bian1, Hong Yang1 , Xinmin Zhang , Limin Chen1, Jingxing Wang，《Development of High Hydrostatic Pressure Applied in Pathogen Inactivation for Plasma》《PBOS ONE》2016 [13]贾培起《高压治疗技术及装备》天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司 项目报告 2019
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