综述2： 人体血浆内的COVID-19能直接灭活吗？发表时间：2020-09-15 06:19 综述2： 人体血浆中COVID-19能直接灭活吗？ 贾培起 概述 COVID-19病毒肆虐全球，2900多万人受到感染，形势非常严峻，目前没有特效药，疫苗还在研制即将投入量产，本文建议科学家和医生可以采用高静水压（HHP）灭活血浆病毒的方法进行感染者的免疫治疗。文中介绍了高压灭活病毒的机理、灭活冠状病毒的实例、高压对血浆有效成分的影响，高压治疗艾滋病患者的治疗过程，以及高压治疗的优越性和广谱性。作者对高压治疗进行了17年的研究，实验证明，该方法安全、有效、简单、快捷，无副作用和不良反应，值得尝试对新冠肺炎患者的治疗。 背景 新冠肺炎已经在全球大规模流行，没有直接灭活病毒的特效药，疫苗在三期临床试验。本文介绍了一种直接灭活人体血浆病毒的物理治疗方法——自体血浆高压净化治疗技术，能够有效地降低人体病毒载量，并完整地保留抗原，并刺激免疫应答，有益于感染病毒患者的治疗，该方法应该对患者血液中的COVID-19灭活同样有效，可以作为一种新的治疗手段。 Weiming Yuan 和 Sean Quan Du用通过验证的数学模型对COVID-19病毒的免疫反应进行了研究。结果表明人体感染病毒后，其两个防御系统（先天性和适应性免疫反应）之间的不利相互作用可能会触发免疫反应过度，从而引发所谓的 “细胞因子风暴”，导致新冠病毒患者死亡。细胞因子是参与细胞信号传导的小蛋白，有助于将免疫细胞募集到感染部位。不过，过量的细胞因子会在某些人中导致感染区域的过度炎症，如新冠肺炎〈COVID-19〉患者肺部，严重损害器官并导致死亡，这已经被无数个死亡病例证实[6]。很多重症患者不是死于新冠病毒，而是死于免疫系统的过度免疫反应。 Zsuzsanna Varga等发表他们的研究报告，认为除呼吸道疾病外，心血管并发症也是COVID-19病的主要威胁。病毒通过血管紧张素转换酶受体感染宿主，该受体在多个器官中表达，包括肺、心脏、肾和肠。他们发现了内皮细胞直接感染和弥漫性内皮炎症的证据，虽然病毒使用上皮肺泡衬里的肺泡内的肺泡细胞所产生的乙酰2受体来感染宿主，从而导致肺损伤，但是它也广泛表达在穿过多个器官的内皮细胞上。内皮功能障碍是微血管功能障碍的主要决定因素，它使血管平衡发生改变，随后出现器官缺血、炎症和相关组织水肿，并处于促凝状态。 他们发现了内皮细胞中存在病毒成分，炎症细胞积累，内皮细胞和炎症细胞死亡的证据。这表明，病毒感染作为病毒介入和宿主炎症反应的直接后果，促进了几个器官内膜炎的诱发[7]。 人体血浆中的病毒若被直接灭活，不仅可以减轻新冠肺炎的病情，有效地控制“细胞因子风暴”，也可以降低血管内皮炎导致肺、心脏、肾脏、肠道等器官的损伤，降低新冠肺炎的死亡率。 方法 1 蛋白质的压力变性 病毒是一种蛋白质，在施加高静水压（HHP）超过一定的阈值时，蛋白质弱键结合的结构就会断裂而发生变性（图1），从而失去活性。在一定的温度范围内，随着压力的升高，病毒失活率越高，蛋白质变性相图呈现椭圆形（图2），病毒失活的曲线也与其相似[1、2]。
图1 超高压导致蛋白质变性示意图 注：左图为天然蛋白质分子结构；右为超高压处理后结构被破坏的蛋白质分子
图2 蛋白质变性示意相图 注：图中椭圆形阴影为天然蛋白质区域，阴影外为变性区域，h:热变性、 p:压力变性、c:冷变性 2 病毒蛋白的压力失活 Emmie de Wit 等基因测序研究结果显示，COVID-19为冠状病毒（图3）与SARS冠状病毒同属冠状病毒科的β属冠状病毒。美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）表示，从显微镜图像来看，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）和最初的SARS-CoV（非典，严重急性呼吸综合征冠状病毒）看起来并无太大不同[3]。
图3 COVID-19的电镜照片（NIAID-RML） 刺突蛋白在新冠病毒进入人体细胞中起着关键作用（图4），不仅感染细胞，而且寄生增殖。超高压处理流感冠状病毒，感染性下降的原因是压力诱导了病毒包膜上的血凝素刺突(HA)，使之融合活性状态发生改变,病毒不能再进入人体的敏感细胞。超高压可使亚稳定状态的血凝素转变成低自由能的不可逆的稳定的融合状态，因而病毒丧失了感染性[3]。 病毒抗原是强键结合的蛋白质，压力不能改变其结构，所以仍能保持其免疫原性，并能诱发人体内的抗体，发挥免疫作用[3]。对有COVID-19这样的包膜病毒来说，经超高压处理后其免疫原性有可能提高。因为压力可导致原本埋藏在膜内或隐蔽在致密的亚单位结合结构中的抗原位置得以充分暴露 ［10］ 。 我们曾经利用超高压灭活病毒，并且成功地制取了禽流感/新城疫的二联疫苗[14]。
图4 冠状病毒结构示意图 流感冠状病毒FM1的压力灭活曲线如图5所示[3]。
图5 超高压对流感病毒FM1感染性的影响（30min） 3高压对血浆成分的影响 高压是否会破坏血浆的活性成分？答案是否定的。 高压处理血浆前要将红血球、血小板等易于损伤的成分分离，高压仅处理血清中的病毒。实验证明，血清在350-400MPa压力下血清蛋白IgG、IgM及凝血因子变化不大，结果所示，只对Ⅷ因子的有一定影响（表1）。而Ⅷ因子的半衰期只有24小时，自身的再造恢复能力较强，不会影响血浆的活性[4、13]。 表1 高压对凝血因子活性的影响
注：500MPa，5min，加压两次 4病毒高压灭活的工作原理 高静水压（HHP）基于巴斯卡原理，操作时将带有病毒血浆密封的塑料血袋，放入超高压容器中，容器中充满水介质，然后通过柱塞加压，高压腔内产生压力，并传递到血袋内部进行施压，高压腔内及血袋内外的任何位置，任何方向的压力是相等的，所以叫做等静压（图6）达到设定压力后，保压一定时间，然后泄压，取出血袋即完成了一次操作，然后将血浆回输给病人[10]。
图6 高等静水压工作示意图 血浆病毒高压灭活的效果，取决于以下几个因素：病毒的种类、压力值、加压时间。 不同的病毒的压力阈值不同，这与病毒的结构有关；在一定的范围内，施加的压力越高，灭活的效果越好；在一定的时间范围内，保压的时间越长，灭活效果越好，这些都需要通过实验进行确定。 结果 1 血浆高压净化的实例——HIV病毒血浆的处理 艾滋病是难以治愈的疾病，通过临床治疗证明自体血浆高压净化是一种有效的治疗方法。 重久 保等对HIV病毒灭活进行了研究，结果表明500MPa、10min高压处理HIV（ⅢB株）的包膜构造已经断裂（图7-B），其内部质液已经泄漏（图7 c）[8]。图8 是大竹 徹进行HIV-1高压处理得到的失活曲线[9]。
图7 电子显微镜观察HIV（ⅢB株）粒子 A：对照组；B、C：25℃、500MPa高压处理10min
图8 高压对HIV-1病毒活性的影响 作者与医疗机构合作对9例艾滋病患者进行了一个疗程的治疗，其中2例呈现阴性；3例病毒载量下降了95%；2例处理血浆的容量不足（仅600ml），尚待继续治疗。 治疗的实际操作如图9所示。治疗前检测病人血液中的病毒载量、体重（估算血量），进行治疗方案的设计，每次抽取的离体血浆不超过600ml。治疗过程如下：① 将高压处理设备安装在单独的房间；② 护士穿戴防护服及面罩，做采血准备；③ 将采血针扎入病人胳膊；④ 单采机采血；⑤ 血袋做好标记；⑥ 单次采血量400-600ml；⑦ 将血袋放入高压腔；⑧ 进行高压处理，压力400MPa、保压时间10min。包括辅助时间，处理一个血袋约需要15min；⑨ 采血、输血过程同时监测心脏情况；⑩ 完成高压处理，回输给病人[12]。 一般情况下，以完成病人整体血浆（约3000-5000ml）处理一遍为一个疗程，根据治疗情况可以适当增减；如果一个疗程后病毒载量仍比较高，可以间隔3-5天再进行第二疗程。 病房用设备每小时可处理4个血袋，每24小时可处理96个血袋。
图9 临床治疗流程 该方法实际上是不断稀释血浆病毒的过程，通过反复操作循环处理，直到人体的血浆全部处理后，达到预期的病毒载量为一个疗程。 处理n次后病毒载量的理论计算是一个迭代公式： TnV0=T0V0-∑Tn-1（αVc） n≥1 式中： Tn 处理n次的滴度 T0 处理前的滴度 V0 人体血浆总量 Vc 血袋处理血浆容积 α 灭活率 n 高压处理血浆次数 实际上，高压灭活病毒是复杂的动态平衡过程，患者自身的免疫能力、病毒抗原引起的抗体、患者初期的病毒载量、病毒灭活的速度、间歇灭活过程的间断时间、殘留病毒的复制速度、病毒库的释放量、病毒高压灭活率、灭活循环次数等因素，这些因素不断改变体内的免疫平衡，但是一定会不断稀释病毒，直到预定的病毒载量。即： Tn=f（T0、α、n、V0、Vc、β、γ、t） 式中： β 殘活病毒的复制速度 γ 抗原诱发抗体的速度 t 高压处理间隔时间 为了提高治疗效果、缩短治疗时间，最好的方案是像透析机一样，连续处理人体血浆，而无需抽出来一袋一袋地处理[11]。 一个疗程结束后，若病毒载量未达到预期，可以继续进行第二个疗程，如有必要还可以配合药物辅助治疗。 2 自体血浆免疫与异体抗体血浆免疫 实践证明康复患者的抗体血浆免疫治疗非常有效，但是自体血浆净化治疗比异体免疫血浆输入治疗有更多的优势。 表2 自体血浆净化免疫与异体抗体血浆免疫的对比
3 自体血浆高压净化免疫治疗的广谱性 由于是物理方法，只要病毒结构适合进行高压处理，无论属于哪类病毒，都可以将其灭活。 该方法可以灭活一系列病毒和致病菌，具有广谱性，例如：艾滋病病毒、流感病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒等；同时还可以灭活大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、葡萄球菌、副溶血性弧菌等致病菌，甚至于对狂犬病、疯牛病、埃博拉等病毒都可以进行高压灭活和临床治疗的研究[2]。 高压净化血浆处理，可以兼顾灭活多种病毒，同时不必担心它们的变异。对于免疫力低下的诸多恶性病患者，血浆被病毒或致病菌致病菌严重污染且无药可治，可以尝试此法进行血浆净化处理的辅助治疗。 结论 自体血浆高压净化免疫治疗是新的治疗方法，安全、有效、简单、快捷、无副作用，在新冠肺炎全球肆虐，无特效药、疫苗研制周期长的情况下，可以尝试用此方法，治疗新冠肺炎患者。 作者与中国的医学专家合作，成功地利用高压灭活冠状病毒，成功地制造了高压灭毒疫苗，成功地灭活血浆病毒而不破坏血浆成分，成功地进行艾滋病临床治疗，因此认为用该方法对COVID-19新冠肺炎的治疗进行临床实验研究，是一个比较成熟的新思路。 致谢 中国开封防病中心孙锦山主任医师等组织了艾滋病临床治疗；中国军事医学科学院野战输血研究所周锡鹏研究员、天津血液中心李忠平主任等在血浆处理及病毒灭活方面进行的大量研究；天津农业大学张安国教授在灭活病毒和制造疫苗方面承担了大量工作，在此一并表示感谢。 参考文献 [1] U. S. Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition. Kinetics of Microbial Inactivation for Alternative Food Processing Technologies High Pressure Processing. June 2, 2000. 29-30 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=28#_np=2_485 贾培起. 超高压对微生物的影响 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司 2019.11-13 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=22#_np=2_492 周密 超高压对甲型流感病毒感染性和免疫性的研究 吉林大学硕士论文 2005.4. 18，25-27 http://www.doc88.com/p-1038773075756.html 周锡鹏、贾培起、马平、吕丽萍、阎舫等.超高压（等静水压）灭活血浆病毒的研究.中国输血杂志 2013年9月第26卷第9期，809-810 http://mall.cnki.net/magazine/article/bloo201309015.htm NIAID-RML. New Images of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 now Avavailable. February 13,2020 https://www.niaid.nih.gov/news-events/novel-coronavirus-sarscov2-images Sean Quan Du，Weiming Yuan.Mathematical modeling of interaction between innate and adaptive immune responses in COVID‐19 and implications for viral pathogenesis.Medical virology.26 march，2020， 5-6 https://www.x-mol.com/paper/1256299460763213824 suzsanna Varga，Andreas J Flammer，Peter Steiger，et al. Endothelial cell infection and endotheliitis in COVID-19.Published online，April 17，2020 https：//doi.org/10.1016/s0140-6736（20）30937-5 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32325026/ 重久 保 大野広志 大竹 徹 森 治代 川畑拓野 泉本洋子 大石 功.高圧処理がヒト免疫不全症ウイルスグ（HIV）および血液细胞成分に及ばす影響.高压生物科学と高压技術 さんえい出版.1997.45-52 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=26#_np=2_485 [9] 大竹 徹.ウイルスの高压不活化と血液製剤への利用.Foods food ingredients J.Jpn.，Vol 210，Mo1,2005.44-47 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=26#_np=2_485 [10] 贾培起,王家中.一体化超高压生物处理设备,[P].中国专利:ZL03130566.0,2003-8-15. http://www2.soopat.com/Patent/CN1488405A 贾培起.压力循环自体血浆净化治疗仪即艾滋病治疗机.[P].中国专利:ZL2010.2.0692000.X http://www.zhuanlichaxun.net/p-6967887.html 贾培起.超高压治疗技术及装备.中国天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司，项目报告.2019.21-22 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=53#_np=2_485 李忠平等，超高压处理对血浆凝血功能的影响 实验报告 2003.9 https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=65#_np=2_484 [14]张安国等，鸡新城疫-禽流感超高静水压灭活二联油乳剂疫苗的研究 研究报告 2004https://web00726.yswebportal.cc/nd.jsp?id=66#_np=2_484
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